ELEKTROFORESIS

MAKALAH BIOKIMIA

ELEKTOFORESIS

Kelas 2 fa 4

Gelombang 8

Kelompok 3

Nurul Hanifah (211211

Rika Antartika (21121174)

Tria Wulandari (211211

Marcelina Syafitri (21121

Mutiara Esya A (2112

SEKOLAH TINGGI FARMASI BANDUNG

LABORATORIUM BIOKIMIA

2013/2014

1.      PRINSIP

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu medan elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah elektroforesis zonan (zonal electrophoresis) di mana protein dipisahkan dari satu campuran yang kompleks kepada jalur (band) melalui migrasi didalam larutan penimbal berair melalui satu matrik polimer dipanggil gel. Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim didalam elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan. Matrik gel boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca atau keping (slab) diantara dua kepingan kaca.

2.      PENDAHULUAN

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel- partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).  Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7). Elektroforesis dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler. Dalam makalah ini dibahas elektroforesis kapiler. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu :  Menggunakan pipa kapiler pada pemisahan elektroforesis.  Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dari 5 V/cm.  Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada kromatogram.  Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar.  Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel.  Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuantitatif, dan mudah digunakan.  Terbatas dalam mengkomsumsi (melibatkan) sejumlah reagent.  Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik separasi lainnya. Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana. CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga reservoir, sebuah kapiler, dan sebuah detektor. Pengaturan dasar dapat diuraikan dengn peningkatan fitur seperti sampel, peralatan injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektr ganda, dan kumpulan fraksi. Berbagai model elektroforesis kapiler dapat dilakukan menggunakan instrumen CE. Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan bahwa elektroforesis kapiler telah dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan kromatografi.

Proses Elektroforesis Kapiler

Alat-alat yang digunakan pada elektroforesis kapiler adalah Kolom kapiler (dengan silika, jendela optis agar bias diamati prosesnya dari luar) Dua buah elektroda.  Power supply (bisa diatur untuk bertegangan tinggi) Detector (sinar UV)  Larutan buffer beserta dua buah tempat penyimpanannya. Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktu yang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom kapiler menuju jendela detektor. Hal-hal yang mempengaruhi mekanisme proses ialah mobilitas elektroforesis (electrophoretic mobility) µep(cm2/Vs), kecepatan elektroforesis (electrophoretic velocity) vep (cm/s), dan besarnya medan listrik (electric field strength) E (V/cm). Hubungannya dapat dilihat pada persamaan dibawah: Kecepatan merupakan hasil kalkulasi dari membagi perpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari detektor. Mobilitas tergantung pada hasil pembagian antara kecepatan dengan besar medan listrik. Ketinggian cairan sampel pada pipa kapiler tergantung pada jenis buffer yang dipakai, kondisi pH dan temperatur. Panjang pipa kapiler yaitu panjang menuju detektor (Ld), dan panjang total (Lt), panjang ketika proses separasi terjadi pada segmen kapiler, Ld , dan panjang keselurahan adalah Lt, selisih atau kelebihan Lt terhadap Ld harus diketahui untuk menghubungkan pipa kapiler pada buffer reservoir. Pada sistem P/ACE excees panjangnya bernilai 7 cm, dengan ukuran panjang ini apabila susunan pipa tersebut dibalikkan maka akan terjadi suatu separasi yang cepat.

Muatan negatif dinding menarik muatan positif ion dari larutan buffer, menghasilkan dua lapisan elektrik. Ketika tegangan yang dilibatkan melewati pipa kapiler, kation yang ada didalam jumlah yang panjang (banyak)pada lapisan ganda (double layer), berpindah secara langsung kadalam katoda dengan mengikutsertakan air. Hasilnya adalah jaringan aliran larutan buffer pada elektroda negatif. Meningkatnya konsentrasi akan mengakibatkan aliran elektroosmosisnya menjadi menurun.

Metode-metode Elektroforesis kolom kapiler

1. Capillary Zone Electrophoresis atau Zona elektroforesis kapiler

2. Isoelectric Focusing atau Pemusatan isoelektrik kapiler

3. Capillary Gel Electrophoresis atau Elektroforesis Kapiler Gel

4. Isotachophoresis atau Isotakoforesis Kapiler

5.Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography atau Misel Kapiler Kromatografi Elektrokinetik

6. Elektrokromatografi Kapiler Pada elektroforesis, campuran senyawa berbeda pada larutan biasanya dikenal sebagai zona relatif sempit, ke dalam sistem pemisah, dan induksi untuk bergerak di bawah pengaruh suatu potensial yang diterapkan.

Sesuai dengan perbedaan pada keefektifan mobilitas dari perbedaan senyawa di bawah pengaruh medan listrik, kemudian campuran berpisah menjadi zona spasial diskrit senyawa tunggal setelah beberapa waktu. Pemisahan elektroforesis bisa dilakukan dengan sistem kontinu atau tidak kontinu. Pada kasus dimana digunakan elektrolit kontinu, larutan yang dinamakan elektrolit dasar membentuk sebuah rangkaian sepanjang jalur perpindahan. Rangkaian ini tidak berubah oleh waktu dan menyediakan sebuah media sambungan untuk aliran arus listrik serta pembentukan medan listrik sepanjang jalur perpindahan.Umumnyaelektrolit dasar adalah sebuah penyangga yang dengan selektif mempengaruhi keefektifan mobilitas. Dengan merubah karakteristik dari sistem elektrolit dasar sepanjang jalur perpindahan, pemisahan bisa dioperasikan baik sebagai kinetik ataupun proses yang tidak bergerak. Pada proses kinetik, komposisi dari elektrolit dasar adalah konstan sepanjang jalur perpindahan. Potensial listrik dan keefekifan mobilitas dari senyawa yang dipisahkan juga konstan. Maka dari itu, senyawa yang berbeda berpindah dengan konstan tetapi kelajuan berbeda dengan arus konstan lewat sistem. CZE, CGE, MEKC, dan CEC merupakan contoh dari pemisahan. Pada proses statis, komposisi dari elektrolit dasar tidak konstan. Medan listik dan keefektifan mobilitas dapat berubah sepanjang jalur perpindahan. Tipe pemisahan ini paling sering digunakan untuk proses pembentukan gradien pH sepanjang jalur perpindahan. Setelah selang waktu, komponen tertentu dari sampel seperti ampholytes, akan berhenti untuk berpindah dan berpusat pada posisi tertentu sesuai pada titik isoelektriknya.

Capillary Gel Electrophoresis

Mekanisme utama pemisahan elektroforesis kapiler gel didasarkan pada perbedaan ukuran zat yang terlarut sebagai analit berpindah dari pori kolom gel yang terisi penuh. Gel berpotensi digunakan untuk pemisahan elektroforesis karena pemisahannya berdasarkan pada “molecular sieving” dan bertindak sebagai media anti konvektif, meminimalisir difusi zat yang terlarutkan yang mengkontribusi pelebaran zona, mencegah penyerapan zat yang terlarut ke dinding kapiler serta membantu eleminasi elektroosmosis. Gel harus memiliki karakter tertentu seperti stabilitas temperatur dan kesesuaian jarak ukuran pori untuk menjadi media elektroforesis yang sesuai. Hijerten dan Zhu menggunakan poliaklrilamide dan agarose gelas kapiler dengan 150µm I.D. untuk pemisahan elektroforesis molekul kecil dan besar. CGE dengan koleksi fraksi telah tampil untuk mikropreparasi purifikasi dari makromolekul. Karger dan rekan kerjanya mendapatkan efisiensi pemisahan tingkat tinggi (hingga 30 juta plat teoritis per meter) menggunakan kolom kapiler berisi gel. Kapiler-kapiler tersebut dipenuhi gel-gel poliakrelamide yang mengandung natrium dodesil sulfat. Teknik ini juga disebut pemisahan SDS-PAGE kapiler dan telah digunakan untuk pemisahan protein-protein, polinukleutida, dan fragmen-fragmen DNA. Kesuksesan yang didapatkan ditandai dengan sebagian teknik digunakan untuk pengembangan prosedur untuk pautan silang akrilamide dan disakrilamide monomer di dalam kapiler sumbu silika. Poliakrilamide hasilnya memiliki struktur gel yang acak yang dapat terikat ke dinding kapiler melalui adisi dari reagen dwifungsi. Ukuran pori ditentukan dari konsentrasi total gel, %T (T=[bis+akril]/V, dimana bis, akril, dan V adalah berat bisakrilamit, berat akrilamit dan total volume) dan konsentrasi dari agen pautan silang, %C (C=[bis+akril]/akril). Ketika gel tersebut terikat pada perukaan kapiler elektroosmosis dapat dieleminasi sejak bentuk protein mengkompleks dengan SDS yang bermuatan negatif, injeksi dan deteksi dilakukan pada ujung katoda dan anoda dari kapiler. SDS-PAGE Kapiler memiliki beberapa keuntungan dibandingkan gel elektroforesis konvensional, termasuk kebutuhan sampel yang kecil, kemungkinan automatisasi dan sensifitas yang tinggi. Dengan mengeksploitasi kemampuan melewati yang tinggi dan pemisahan dua dimensi dari susunan gel dan cepat dan penetapan masa molekul yang efisien dan kuantitas dari susunan kapiler, keuntungan tinggi telah dihasilkan dari pemisahan dan analisa variasi biomolekul besar yang luas. Metode seperti ini dilakukan dengan melibatkan gel, gel diisikan kedalam pipa kapiler contohnya polyacrylamida, dan agarosa. Metode ini penting diterapkan pada saat melakukan separasi DNA.

3.     PROSES SDS- PAGE

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atauprotein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya olehgaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satukutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektrode positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

4.      JURNAL PRAKTIKUM

LAPORANPRAKTIKUM ELEKTROFORESIS

GEL AGAROSE | BIOTEKNOLOGI

TUJUAN

1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.

2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul- molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negative (katoda) (Klug and Cummings, 1994). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing- masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2. Gel alkalin agarosa , berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar (Davis dkk. 1994). Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relative tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010). Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.

2. Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.

3. Chamber : digunakan sebagai wadah gel agarose.

4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

ALAT DAN BAHAN

ALAT

1. Satu set alat elektroforesis

2. Mikropipet dan tip

3. Gel Doc

4. Power Supply

5. Parafilm

BAHAN

1. DNA Marker

2. Produk DNA

3. Ethidium Bromide (EtBr)

4. dd H2 O

5. Gel Agarose

6. Loading Buffer (Loading dye)

7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)

8. Akuades

CARA KERJA

Pembuatan Gel Agarose

0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE .

Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.

Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C.

Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.

Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras.

Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan.

Elektroforesis Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.

1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet.

Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose. Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/ well yang berada pada paling tepi atas dan bawah.

Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply. Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.

Dokumentasi

Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama ± 15 menit. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa ( DNA dan Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini. Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005). Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif ( Elektroforesis ) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005). Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997).  

Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb- nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO 4 ) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996). Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994). Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.

Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994). Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.        Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.        Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.        Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.        Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.        Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.        Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.        Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993).

 Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan. Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.

KESIMPULAN

1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis  elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.

2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose.

3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.

4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.